Dipl. Biol. Martina Veith, PD Dr. Timm Greulich

Mittlerweile ist es 59 Jahre her, dass Laurell und Eriksson die ersten Fälle von Alpha-1-Antitrypsin-Mangel (AATM) beschrieben haben. Seither konnte viel über die Erkrankung gelernt werden (1). AATM ist die häufigste Erbkrankheit bei Erwachsenen (2), und obwohl ca. 120.000 Menschen in Europa den Pi*ZZ-Genotyp tragen (Pi*ZZ ist eine häufige Mutation bei AATM), ist nur ein geringer Teil hiervon diagnostiziert und wird behandelt (3). Eine frühzeitige Diagnose ist jedoch sehr wichtig, damit die Ärzte vorbeugende Maßnahmen ergreifen und bei Bedarf eine angemessene Behandlung einleiten können.

Das Alpha-1-Antitrypsin-Labor an der Universität Marburg wurde 2003 gegründet und ist europaweit eines der führenden Labore, wenn es um die Diagnostik von Alpha-1-Antitrypsin-Mangel geht. Die meisten spezialisierten Labore haben ihren eigenen diagnostischen Algorithmus für die AATM-Detektion entwickelt, und somit unterscheidet sich die Abfolge der diagnostischen Verfahren von Labor zu Labor.

Die AATM-Diagnose sollte in der Regel mit der Bestimmung der AAT-Konzentration im Blut beginnen. Bei einem begründeten Verdacht auf AATM, z. B. wenn der Patient anhaltenden Husten, Auswurf oder Atemnot hat, sollte der Hausarzt oder Lungenfacharzt (Pneumologe) die Bestimmung des Alpha-1-Antitrypsin (AAT)-Spiegels im Serum, i. d. R. in einem heimatnahen, kommerziellen Labor veranlassen. Bei einem Serumspiegel von weniger als 90 mg/dl (0,9 g/L), sollte anschließend die molekulargenetische Analyse zum Nachweis verschiedener Mutationen eingeleitet werden, um einen möglichen AAT-Mangel auf DNA-Ebene zu bestätigen.

In der DNA (englisch deoxyribonucleic acid) sind die Informationen zur Entwicklung und Funktion der Lebewesen kodiert. Jeder Abschnitt der DNA, der für ein bestimmtes Protein kodiert, wird als Gen bezeichnet. Die DNA ist also der Bauplan (genetischer Code) für die Herstellung von Proteinen. Ein Mangel an AAT beruht auf Mutationen (Veränderungen) im genetischen Code für AAT, dem SERPINA1-Gen (Serin-Proteasen-Inhibitor A1-Gen). Auf diesem Abschnitt der DNA wird nach Mutationen geschaut.

Das Alpha-1-Antitrypsin-Labor Marburg bietet einen Service zur kostenfreien Durchführung der molekulargenetischen Analyse an, unterstützt von Grifols.

Seit Juni 2021 stehen hierfür zwei Testverfahren zur Verfügung:

1. Das AlphaKit® von der Firma Grifols (DNA wird aus Trockenblut gewonnen; siehe hier auch Artikel „Was passiert mit meiner Probe im Labor“) und
2. ein neues Testverfahren mit dem sogenannten „AlphaID®“(Grifols). Dieses erfolgt über einen einfachen Wangenabstrich (Abbildung 1). Mithilfe eines sterilen Schwämmchens wird Wangenschleimhaut (Epithelzellen) abgestreift. Die Probe wird auf einer Webplattform durch den Arzt mit einem Barcode registriert. Jeder AlphaID® hat einen separaten Barcode. Die Probe mit dem Barcode wird anschließend per Post an das Alpha-1-Antitrypsin-Labor Marburg geschickt.

Aus den Epithelzellen dieser Probe lässt sich DNA gewinnen und innerhalb weniger Stunden gelingt mittels einer Multiplex-Polymerase-Kettenreaktion (englisch polymerase chain reaction, PCR) der parallele Nachweis auf die 14 häufigsten AAT-Mutationen (Tabelle 1). Wichtig ist jedoch, dass der Spender 30 Minuten vor der Entnahme des Wangenschleimhautabstrichs nicht essen, trinken (auch kein Wasser!), rauchen oder Kaugummi kauen darf.

Die Information über die Ergebnisse der Testung auf AATM mit dem AlphaID® kann der Arzt wenige Tage nach Einsendung der Probe über das Webportal abrufen. Nur der Arzt kann mittels des Probenbarcodes die Ergebnisse mit den Patientendaten in Verbindung bringen.

Bei Ergebnissen, die nicht durch die PCR zu erklären sind oder bei dem Verdacht auf seltene Mutationen, können weitere Analysen notwendig sein. Es gibt die Möglichkeit, den genetischen Code für das Alpha-1-Antitrypsin zu sequenzieren. Hierbei wird die Reihenfolge der Bausteine (Basen) in der DNA bestimmt und danach mit einer Vorlage (Referenzsequenz) verglichen.

Ein Vorteil beim AlphaID® ist der, dass kein zweites Mal Blut entnommen werden muss (nicht-invasiver Test) und die Anwendung sehr einfach ist. Dieser Test ist damit auch für Säuglinge, Kleinkinder und ängstliche Menschen geeignet.

Je nach Art und Stelle der Mutation auf dem SERPINA1-Gen ist das AAT-Protein in der Aktivität wenig reduziert, stark reduziert oder das AAT-Protein fehlt komplett. Somit ist die Schutzfunktion von AAT (enzymatischer Abbau von Lungengewebe) nicht mehr oder nur noch teilweise vorhanden:

Tabelle 1: Die 14 Mutationen, die mit dem A1AT Genotyping Test von Progenika Biopharma (Grifols) direkt detektiert werden können.

„Was passiert mit meiner Probe im Labor“

Dipl. Biol. Martina Veith, PD Timm Greulich

Alpha-1-Anitrypsin (AAT) wird vor allem in der Leber gebildet und ist praktisch in allen Körpergeweben zu finden. Es ist eine Art Schutzeiweiß, denn es dient als wichtiger Gegenspieler von körpereigenen Stoffen, die Gewebe abbauen können. Ein Mangel an Alpha-1-Antitrypsin (AATM) beruht auf Mutationen (Veränderungen) im genetischen Code für AAT und bewirkt eine verminderte und/oder fehlerhafte Synthese und Freisetzung von AAT-Molekülen, was zu Erkrankungen wie beispielsweise einem Lungenemphysem oder Lebererkrankungen führen kann.

Der Hausarzt oder Lungenfacharzt (Pneumologe) kann bei einem begründeten Verdacht auf AATM eine Blutuntersuchung veranlassen, z.B. wenn der Patient anhaltenden Husten, Auswurf oder Atemnot hat. Der erste diagnostische Schritt erfolgt durch die quantitative Bestimmung des AAT-Spiegels im Serum oder durch den AlphaKit Quick Screen (Grifols). Der AAT-Spiegel wird i.d.R. in einem heimatnahen, kommerziellen Labor durchgeführt. Wird ein erniedrigter Serumspiegel festgestellt (< 90 mg/dl), sollte anschließend die molekulargenetische Analyse zum Nachweis verschiedener Mutationen initiiert werden, um den AAT-Mangel auf DNA-Ebene zu bestätigen und daraus Rückschlüsse für eine angepasste Therapie ziehen zu können. Bislang sind über 100 genetische Varianten des AAT-Proteins bekannt. Um diese verschiedenen Varianten finden zu können, stehen diagnostische Verfahren, sowohl auf DNA-Ebene, als auch auf Protein-Ebene zur Verfügung.

Für die Analyse wird Blut aus der Fingerbeere/Ohrläppchen auf ein spezielles Filterpapier (AlphaKit® von Grifols) getropft, welches in das Alpha-1-Zentrum nach Marburg geschickt wird. Die AlphaKits® werden im Labor sorgfältig auf Vollständigkeit (Name, Geburtsdatum, Arztanschrift und Unterschrift) geprüft und in eine Datenbank eingegeben. Alle Proben werden genotypisch (auf DNA-Ebene) auf spezielle Mutationen, die für den AATM verantwortlich sind, untersucht.

Seit Juni 2016 hat das Marburger Alpha-1-Zentrum zusammen mit Grifols und seiner Tochterfirma Progenika, eine neue Methode, basierend auf der xMAP-Technologie (Luminex®), entwickelt, um die genotypische Untersuchung noch spezifischer und zeitsparender durchführen zu können (Veith et al., 2019 (DOI: 10.2147/COPD.S224221)). Üblicherweise wird im kommerziellen Labor mittels einer Polymerase-Kettenreaktion (englisch polymerase chain reaction (PCR)) die DNA auf zwei Mutationen geprüft: die Z-Mutation und die S-Mutation.
Bei dem neuen Verfahren kann nun mittels einer Multiplex-PCR gleichzeitig auf 14 verschiedene Mutationen getestet werden. Grundlage der Luminex®-Technologie sind mikroskopisch kleine Polystyrol-Kügelchen, sogenannte „Beads“, die als Trägermaterial für biochemische Nachweisreaktionen dienen. Derzeit sind 100 verschiedene „Bead“-Typen verfügbar, die sich in ihrem Fluoreszenzfarbton unterscheiden. Die verschiedenen „Bead“-Typen können jeweils mit unterschiedlichen Nachweisreagenzien beladen werden (z.B. DNA-Sonde). Durch Kombination unterschiedlicher „Beads“ in einem Testansatz können gleichzeitig bis zu 100 verschiedene Nachweisreaktionen in einem sehr geringen Probenvolumen durchgeführt werden.

Die DNA wird aus dem AlphaKit® isoliert und mittels der Multiplex-PCR werden die zu untersuchenden DNA-Stücke vervielfältigt und an die Bead-gekoppelten Sonden gebunden. So befindet sich z. B. die Z-Mutation auf dem AAT Gen an der Stelle 1096. Normalerweise befindet sich an dieser Position Guanin, bei der Z-Mutation findet man stattdessen Adenin (Adenin und Guanin sind zwei von vier verschiedenen universellen DNA Bausteinen). Durch diese Punktmutation wird später beim „Proteinzusammenbau“ an der Stelle 366 die Aminosäure Lysin statt Glutamin verwendet, was wiederum zu einer Fehlfaltung des eigentlichen Proteins des Alpha-1-Antitrypsins führt und somit zur Agglomeration in der Leber.

Der „Bead“ wird mit einer bestimmten DNA-Sonde gekoppelt und zwar mit dem Gegenstück der zu untersuchenden Mutation. Nach der PCR können nun die zu untersuchenden Einzelstränge zu den „Bead“-Sonden gegeben werden. Diese Einzelstränge wurden während des Vervielfältigungsprozesses (PCR) mit Biotin markiert. Biotin dient dazu, zusammen mit einem Farbstoff (SAPE) ein detektierbares Signal zu erzeugen. Im Fall, dass sich an der zu untersuchenden Stelle eine Mutation befindet, wird sich der Einzelstrang an die Sonde mit ausgetauschter Base binden, andernfalls an die Sonde ohne Mutation.

Die Analyse und Auswertung der Bead-basierten Tests erfolgt mit dem Luminex®-Analysesystem. Es basiert auf der Methode der Durchflusszytometrie unter Verwendung zweier unterschiedlicher Laser. Ein roter Laser identifiziert den Farbcode der „Beads“ während gleichzeitig über einen zweiten, grünen Laser der quantitative Nachweis stattfindet.

Neben der genotypischen Analyse wird bei Vorhandensein einer Mutation im Marburger Alpha-1-Zentrum immer auch die phänotypische Analyse (Analyse auf der Protein-Ebene) zur Sicherheit durchgeführt. Hierfür wird das Protein aus dem Filterpapier aufgereinigt und mittels einer Methode namens „isoelektrischen Fokussierung“ (IEF) aufgetrennt. Die IEF ist ein biochemisches Verfahren zur Trennung von Proteinen nach ihrem Gehalt an sauren und basischen Aminosäuren.

Bei seltenen Mutationen können weitere Analysen notwendig sein. Um auch diese aufspüren zu können, haben wir die Möglichkeit, den genetischen Code für das Alpha-1-Antitrypsin zu sequenzieren. Hierbei wird die Reihenfolge der Basen in der DNA bestimmt und danach mit einer Vorlage verglichen.

Somit stehen dem Marburger Alpha-1-Zentrum mehrere Methoden zur Verfügung, um eine sichere Diagnose bei AATM stellen zu können.